Edição gênica em células de bovinos para inserção de genes de interesse no Locus H11 do genoma bovino

Resumo

A pecuária bovina tem grande influência nas exportações brasileiras e consequentemente na economia do país. As doenças infecciosas e parasitárias se tornam grandes impedimentos para o crescimento da atividade, uma vez que afetam significativamente a produtividade dos animais. Com o desenvolvimento de novas biotecnologias, é possível a aplicação de técnicas para obtenção de animais geneticamente modificados, uma vez que a transgenia animal é uma ferramenta relevante para a obtenção de animais mais resistentes a fatores abióticos e bióticos. Dentre as técnicas mais atuais de edição e modificação de genes podemos citar a CRISPR/Cas9. A técnica de CRISPR foi descoberta através de uma análise de como o sistema imunológico da bactéria funciona contra vírus, que insere seu material genético no genoma da bactéria e serve de molde para o gRNA, que se une com a Cas9 e procura uma sequência complementar no genoma de outro vírus infectante para gerar uma quebra na fita, podendo resultar em inserções ou deleções de genes. Para a realização da técnica de CRISPR/Cas9, é necessário um fluxo de trabalho para triagem, composto por etapas fundamentais: construção e sequenciamento dos vetores, produção dos guias para Cas9 e dos primers; transformação do vetor; transfecção de células; amplificação por PCR e ensaios de digestão com enzima endonuclease T7E1 para avaliar a edição genômica realizada. No laboratório ela pode ser usada através de transfecção celular, um método que possibilita o transporte de genes exógenos para dentro das células de interesse, para isso o ensaio de digestão com a enzima T7Endonuclease1 (T7E1) é utilizada, já que reconhece e corta as regiões do DNA que não foram pareadas de forma correta na etapa anterior (PCR), possibilitando identificar as regiões que tiveram sucesso na indução de edição nos genes alvos. O objetivo da pesquisa foi investigar a aplicação do sistema CRISPR/Cas para edição genômica e estabelecer a metodologia mais eficiente para inserir o gene de interesse em um local específico e seguro do genoma denominado locus H11, para que futuramente seja possível produzir embriões bovinos transgênicos. Este trabalho demonstrou que os testes e análises para padronização dos procedimentos e a escolha dos melhores parâmetros são extremamente importantes. Os resultados mostram que é importante saber a origem da célula transfectada, já que cúmulus apresentou bandas fantasmas e impossibilitou a análise de edição. Quanto a transfecção, o melhor reagente foi o Xfect armazenado no congelador que apesar de não apresentar uma mortalidade celular ideal. Além disso, ficou comprovado também a importância de um controle positivo da enzima T7E1 e do controle negativo com DNA de células não transfectadas no ensaio de digestão. A confirmação da expressão heteróloga de genes de interesse e da edição genômica não foi possível até o momento, mas pode-se concluir que a técnica de CRISPR é uma ferramenta de fácil execução e relativamente rápida, e com os melhores parâmetros definidos, valida a abordagem para experimentos futuros.